دراسة كيميائية خلوية وجزيئية لانتاج قلويدات التروبان من مزارع )Hyoscyamus aureus (L.( الكالوس لنبات البنج الذهبي

Abstract

نفذ هذا البحث في مخابر الهيئة العامة للتقانة الحيوية، خلال الفترة 2015 - 2019، بهدف تحديد استجابة كالوس نبات البنج الذهبي (Hyosyames aureus)، ودراسة ديناميكية نموه على أوساط مغذية مختلفة التركيب وخالية من منظمات النمو النباتية، بالاعتماد على الوزن الرطب للكتلة الخلوية كمؤشر على قوة نمو الكالوس، بالإضافة إلى دراسة التباينات الجسمية Somacional variation التي يمكن أن تحدث نتيجة اختلاف تركيب الوسط المغذي للكالوس بالمقارنة مع النبات الأم، باعتماد تقنية التكرارات البسيطة الترادفية البينية ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) باستعمال 25 مرنسة، كما هدف البحث إلى معرفة تأثير مكونات الوسط المغذي إضافة إلى تأثير تغير تعبير أهم المورثات المرمزة للأنزيمات الداخلة في مسار التخليق الحيوي القلويدات التروبان مثل (N-Putrescine (PMT (TRI) Hyoscyamine 68 Hydroxylase (H6H) Methyle Transferase في المحتوى القلويدي Tropinon Reductase II (TRII(و ،Tropinon Reductase 1 في الخطوط الخلوية Cellular lines لكالوس نبات البنج الذهبي، وذلك عن طريق تقدير مستويات التراكم النسخي mRNA الخاص بهذه المورثات، باستعمال تقنية تفاعل بوليمراز التسلسلي في الوقت الحقيقي Real Time PCR، إضافة إلى معرفة التضاعفات الصبغية الحاصلة في المزارع الخلوية خلال أطوار نمو الكالوس.

بينت نتائج الدراسة الشكلية أن منحنى النمو الخلايا الكالوس اتخذ شكل المنحنى السيني Sigmoid في جميع الأوساط المختبرة، حيث بلغت سرعة نمو الخلايا أقصى معدلاتها في الطور الأسي Exponential Phase من اليوم 15 حتى اليوم (35) في جميع الأوساط، مع تفوق الشاهد في وزن الكتلة الخلوية، ويُفسر نجاح تشكل الكالوس ونموه في الأوساط المغذية الخالية من منظمات النمو إلى احتواء هذه الأوساط (5) 6 (100) على مستوى مرتفع من العناصر المغذية، وتراكيز مرتفعة من السكروز 5000، 100 غ ل ) على التوالي، بالإضافة إلى ظاهرة التطبع الهرموني Hormone habituation التي تحصل نتيجة استمرار نمو الكالوس في وسط الإدامة بوجود منظمات النمو، حيث تتمكن خلايا الكالوس بمرور الزمن من النمو في وسط خال من منظمات النمو . بينت نتائج الدراسة الكيميائية تفوق معاملة الشاهد 5C بمحتواها من قلويدات التروبان Tropane Alkaloids على الخطوط الخلوية 50 و 60 و 100 ، حيث كان تركيز القلويدات )%0.21( الأعلى في الطور الأسى (15-35) يوم) (0.49%) و (0.36%) و (0.29%) و في الخطوط الخلوية SCor و 5C و 60 و 100 على التوالى بالنسبة للهيوسيامين Hyoscyamine، بينما كان تركيز السكوبولامين Scopolamine ضئيلاً بالمقارنة مع الهيوسيامين ، ويعود ذلك إلى حقيقة أن نبات البنج بعد من الأنواع النباتية الفقيرة بالسكوبولامين. كما تفوق الخطين الخلويين SC و 6C على الخط الخلوي 100 معنوياً بمحتواه من القلويدات خلال مرحلتي الطور الأسي Exponential Phase وطور الثبات Platue Phase.

أثبتت نتائج الدراسة الجزيئية فعالية جميع المرنسات المستعملة في إعطاء تعددية شكلية بين الخطوط الخلوية المدروسة، كما أظهر التحليل العنقودي Cluster analysis انفصال النبات الأم (المانح Donor) عن الخطوط الخلوية للكالوس بمسافة قدرها 0.7614، بينما انفصلت الخطوط الخلوية للكالوس إلى تحت مجموعتين، ضمت المجموعة الأولى الخط الخلوي 100 منفرداً، في حين ضمت الثانية الخطوط الخلوية (51) 5 (0) بمسافة قدرها 0.4416 بينهما، وكان الخطان الخلويان 5 SC الأقرب إلى بعضهما وراثياً، تبين هذه النتائج وجود تباين وراثي بين الخطوط الخلوية لمزارع الكالوس مع أنها أخذت من المصدر نفسه الخط الخلوي الأم (50)، ويعزى هذا إلى دور مكونات وسط النمو في إحداث تغير في التركيب الوراثي للمادة النباتية، ما يؤكد أن مزارع الكالوس يمكن أن تكون مصدراً للاختلافات الوراثية

وأن تقنية ISSR أداة فعالة في كشف هذه الاختلافك.

وعند قياس تعبير المورثات المرمزة للأنزيمات الداخلة في مسار تخليق القلويدات، تبين أن مرحلة الطور الأسي قد شهدت أعلى قيمة لتعبير المورثة المرمزة للأنزيم (4.563) و (7.728) ضعف أكبر في الخطوط الخلوية 50 و 100 على التوالي بالمقارنة مع الشاهد 5001، بينما كانت أكبر قيمة لها في الخط الخلوي 60 بعمر 5 أيام (3.117) ضعف أكبر بالمقارنة مع الشاهد، وبالنسبة للمورثة المرمزة لأنزيم H6H تحققت أعلى قيمة لتعبيرها في بداية الطور المتلكئ La Phase ) أيام، حيث بلغت (2.676) و (3.364) و (2.297) ضعف أكبر بالمقارنة مع الشاهد 5C في كل من الخطوط الخلوية 65 ، 100 على التوالي.

لكن لم يترافق هذا التفوق في التعبير المورثي مع زيادة في تركيز القلويدات المنتجة، ويعود ذلك بشكل أساسي إلى انحراف مسار التفاعل في بداية طريق التخليق الحيوي القلويدات التروبان من بوتريسين - تروبان Putrescine - Tropane) إلى بوتريسين - سبير ميدين ) - Putrescine

Spermidine)، ما أثر سلباً في كمية قلويدات التروبان المنتجة.

وعلى الرغم من تباين الصيغة الصبغية في الخطوط الخلوية بالمقارنة مع النمط الصبغي الثنائي 2034 في النبات الأم المانح (Donor)، كانت الهيئة الشكلية السائدة للصبغيات هي الصيغة الصبغية الثنائية مع انحرافاتها Aneuploidy، حيث شكلت ما نسبته 78% و 76% و 60% و 73% في الخطوط الخلوية 50 S 100 على التوالي في الطور المتلكئ، مع وجود نسبة قليلة للصبغة الصبغية الثلاثية Triploidy (3) والرباعية Tetraploidy (4)، في حين غابت الخلايا ذات الصبغة الصبغية المتعددة Polyploidy بينما انخفضت نسبة الصيغة الصبغية الثنائية Diploidy في الطور الأسي مع بقائها سائدة في جميع الخطوط الخلوية المدروسة باستثناء الشاهد 500 وارتفعت بالمقابل كل من الصيغ ، Polyploidy 4) والمتحدةx) Tetraploidy 3) والرباعية( Triploidy الصبغية الثلاثية وكذلك الأمر في طور الثبات.