دراسة كيميائية خلوية وجزيئية لإنتاج قلويدات التروبان من مزارع )Hyoscyamus aureus L.( الكالوس لنبات البنج الذهب

Abstract

نفذ هذا البحث في مخابر الهيئة العامة للتقانة الحيوية، خلال الفترة 2015 - 2019، بهدف تحديد استجابة كالوس نبات البنج الذهبي (Hyosyamus aureus)، ودراسة ديناميكية نموه على أوساط مغذية مختلفة التركيب وخالية من منظمات النمو النباتية بالاعتماد على الوزن الرطب للكتلة الخلوية كمؤشر على قوة نمو الكالوس، بالإضافة إلى دراسة التباينات الجسمية Somad onal variation التي يمكن أن تحدث نتيجة اختلاف تركيب الوسط المغذي للكالوس بالمقارنة مع النبات الأم، باعتماد تقنية التكرارات البسيطة الترادفية البيئية ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) باستعمال 25 مرئسة، كما هدف البحث إلى معرفة تأثير مكونات الوسط المغذي إضافة إلى تأثير تغير تعبير أهم المورثات المرمزة للأنزيمات الداخلة في مسار التخليق الحيوي القلويدات التروبان مثل (N-Putrescine (PMT (TRI) Hyoscyamine 6ẞ Hydroxylase (H6H) Methyle Transferase في المحتوى القلويدي Tropinon Reductase II (TR) II( و،Tropinon Reductase I في الخطوط الخلوية Cellular lines الكالوس نبات البنج الذهبي، وذلك عن طريق تقدير مستويات التراكم النسخي لـ mRNA الخاص بهذه المورثات، باستعمال تقنية تفاعل بوليمراز التسلسلي في الوقت الحقيقي Real Time PCR، إضافة إلى معرفة التضاعفات الصبغية الحاصلة في المزارع الخلوية خلال أطوار نمو الكالوس بينت نتائج الدراسة الشكلية أن منحنى النمو الخلايا الكالوس اتخذ شكل المنحنى السيني Sigmoid في جميع الأوساط المختبرة، حيث بلغت سرعة نمو الخلايا أقصى معدلاتها في الطور الأسي Exponential Phase من اليوم 15 حتى اليوم (35) في جميع الأوساط، مع تفوق الشاهد في وزن الكتلة الخلوية، ويُفسر نجاح تشكل الكالوس ونموه في الأوساط المغذية الخالية من منظمات النمو إلى احتواء هذه الأوساط (5) 6 (100) على مستوى مرتفع من العناصر المغذية، وتراكيز مرتفعة من السكروز 3 0 0 0 60، 100 غ. لا) على التوالي، بالإضافة إلى ظاهرة التطبع الهرموني Hormone habituation التي تحصل نتيجة استمرار نمو الكالوس في وسط الإدامة بوجود منظمات النمو، حيث تتمكن خلايا الكالوس بمرور الزمن من النمو في وسط خال من منظمات النمو.بينت نتائج الدراسة الكيميائية تفوق معاملة الشاهد SC01 بمحتواها من قلويدات التروبان Tropane Alkaloids على الخطوط الخلوية 50 و 60 و 100 ، حيث كان تركيز القلويدات )%0.21( الأعلى في الطور الأسى (15-35) يوم) (0.49%) و (0.36%) و (0.29%) و في الخطوط الخلوية 5001 و 50 و 60 و 100 على التوالى بالنسبة للهيوسيامين Hyoscyamine، بينما كان تركيز السكوبولامين Scopolamine ضئيلاً بالمقارنة مع الهيوسيامين ، ويعود ذلك إلى حقيقة أن نبات البنج يعد من الأنواع النباتية الفقيرة بالسكوبولامين. كما تفوق الخطين الخلويين 50 و 60 على الخط الخلوي 100 معنوياً بمحتواه من القلويدات Platue Phase وطور الثبات Exponential Phase خلال مرحلتي الطور الأسي أثبتت نتائج الدراسة الجزيئية فعالية جميع المرئسات المستعملة في إعطاء تعددية شكلية بين الخطوط الخلوية المدروسة، كما أظهر التحليل العنقودي Cluster analysis انفصال النبات الأم (المانح (Donor) عن الخطوط الخلوية للكالوس بمسافة قدرها 0.7614، بينما انفصلت الخطوط الخلوية للكالوس إلى تحت مجموعتين، ضمت المجموعة الأولى الخط الخلوي 100 منفرداً، في حين ضمت الثانية الخطوط الخلوية (51) 5 (60) بمسافة قدرها 0.4416 بينهما، وكان الخطان الخلويان 501 الأقرب إلى بعضهما وراثياً. تبين هذه النتائج وجود تباين وراثي بين الخطوط الخلوية لمزارع الكالوس مع أنها أخذت من المصدر نفسه (الخط الخلوي الأم (501) ، ويُعزى هذا إلى دور مكونات وسط النمو في إحداث تغير في التركيب الوراثي للمادة النباتية، ما يؤكد أن مزارع الكالوس يمكن أن تكون مصدراً للاختلافات الوراثية وأن تقنية ISSR أداة فعالة في كشف هذه الاختلافات وعند قياس تعبير المورثات المرمزة للأنزيمات الداخلة في مسار تخليق القلويدات، تبين أن مرحلة الطور الأسي قد شهدت أعلى قيمة لتعبير المورثة المرمزة للأنزيم (4.563) و (7.728) ضعف أكبر في الخطوط الخلوية 50 و 100 على التوالي بالمقارنة مع الشاهد 5Co، بينما كانت أكبر قيمة لها في الخط الخلوي 6 بعمر 5 أيام (3.117) ضعف أكبر بالمقارنة مع الشاهد، وبالنسبة للمورثة المرمزة لأنزيم H6 تحققت أعلى قيمة لتعبيرها في بداية الطور المتلكئ Lag Phase ) أيام، حيث بلغت (2.676) و (3.364) و (2.297) ضعف أكبر بالمقارنة مع الشاهد 5Co1 في كل من الخطوط الخلوية 50 60 ، 100 على التوالي لكن لم يترافق هذا التفوق في التعبير المورثي مع زيادة في تركيز القلويدات المنتجة، ويعود ذلك بشكل أساسي إلى انحراف مسار التفاعل في بداية طريق التخليق الحيوي القلويدات التروبان من بوتريسين - تروبان Putrescine - Tropane) إلى بوتريسين - سبيرميدين ) - Putrescine Spermidine)، ما أثر سلباً في كمية قلويدات التروبان المنتجة وعلى الرغم من تباين الصيغة الصبغية في الخطوط الخلوية بالمقارنة مع النمط الصبغي الثنائي 34=2n في النبات الأم المانح (Donor)، كانت الهيئة الشكلية السائدة للصبغيات هي الصيغة الصبغية الثنائية مع انحرافاتها Aneuploidy، حيث شكلت ما نسبته 78% و 76% و 60% و 73% في الخطوط الخلوية 51 50 60 10 على التوالي في الطور المتلكئ، مع وجود نسبة قليلة للصيغة الصبغية الثلاثية Triploidy (3) والرباعية Tetraploidy (4)، في حين غابت الخلايا ذات الصيغة الصبغية المتعددة Polyploidy بينما انخفضت نسبة الصيغة الصبغية الثنائية Diploidy في الطور الأسي مع بقائها سائدة في جميع الخطوط الخلوية المدروسة باستثناء الشاهد 500 وارتفعت بالمقابل كل من الصيغ ، Polyploidy 4) والمتعددة( Tetraploidy 3) والرباعية( Triploidy الصبغية الثلاثية وكذلك الأمر في طور الثبات.