أمثلة إنتاج إنزيم غلوكوز إيزوميراز Glucose isomerase من عزلات محلية من بكتريا .Streptomyces spp وتحسين إنتاجه باستخدام بعض الطرائق الوراثية

Abstract

جمعت 32 عينة تربة من مناطق مختلفة من القطر العربي السوري خلال عامي 2010 و 2011, عزل منها 40 عزلة بكتريا تابعة للجنس Streptomyces منها 8 عزلات من تربة مدينة دمشق 5 من مدينة حماة 5 من مدينة حمص، 6 من تدمر، 5 من دير الزور ، 4 من اللاذقية 3 من درعا، 4 من السويداء شخصت العزلات مورفولوجياً وفيزيولوجياً تبعاً للطرائق )International Streptomyces ISP المتبعة في المشروع الدولي للستريتوميسيس (Project، وبين التشخيص أن العزلات تنتمي إلى تسعة وعشرين نوعاً مختلفا من بكتريا جنس ستربتومايسيس . غربلت العزلات لتقييم مقدرتها على إنتاج إنزيم غلوكوز إيزوميراز باستخدام أوساط انتقائية صلبة بالاعتماد على كثافة النمو كمؤشر على استهلاك سكر الزيلوز كمصدر للكربون ومن ثم أوساط سائلة لاختبار الفعالية الإنزيمية استخلص الإنزيم بتحطيم الخلايا باستخدام الـ CTAB بتركيز %0.1 ، من ثم قدرت فعاليته باستعمال الغلوكوز كمادة أساس (ركيرة) و قيس الناتج بطريقة لونية باستخدام المطياف الضوئي عند طول موجة 560 نانومتر، وكان أفضل إنتاج للإنزيم من قبل العزلة D3 والمصنفة ضمن النوع roseiscleroticus . حيث بلغت الفعالية الإنزيمية لها 5.2 وحدة / مل. استعملت مجموعة من المواد منها منظفات ومذيبات عضوية لتحطيم الخلايا واستخلاص إنزيم غلوكوز ايزوميريز من بكتريا Sroseiscleroticus اشتملت تلك المواد على الكلوروفورم و 80 Tween و (SDS) و (DMSO) و (CTAB) بتركيز %0.1% لكل منها وأظهرت النتائج تفوق CTAB حيث بلغت فعالية الإنزيم في المستخلص 5.57 وحدة / ملطبقت عملية التطفير على العزلة Sroseiscleroticus D3 باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (254) نانو متر على ارتفاع 10 سم من الأطباق وتم الحصول على 93 طفرة مقاومة للأشعة وتفوقت الطفرة ذات الرقم 4 في زمن تعرض لمدة 60 ثانية على باقي الطفرات حيث بلغت الفعالية الإنزيمية لإنزيم غلوكوز إيزوميراز المنتج منها 7.44 وحدة / مل ورمزت هذه الطفرة بـ roseiscleroticus Mt4 . وبالتالي تفوقت هذه الطفرة عن العزلة الأصلية بنسبة %43 في إنتاجيتها للإنزيم. جرت أمثلة ظروف إنتاج إنزيم غلوكوز إيزوميراز من البكتريا S. roseiscleroticus M14 باستخدام البرنامج الإحصائي (RSM)، أظهرت النتائج بأن أعلى قيمة الفعالية الإنزيم والتي بلغت 11.42 وحدة مل كانت عند درجة حرارة 25 س ، والرقم الهيدروجيني 6 ومدة التحضين 48 ساعة، وتركيز الزيلوز 15 غ/ل، وبوجود كل من أيونات المغنزيوم والكوبالت بتركيز 0.05% لكل منهما. درس تأثير كل من درجة الحرارة والرقم الهيدروجيني وتركيز الركيزة (glucose) وتركيز بعض Cu( الشوارد المعدنية في فعالية إنزيم )Mg, Co2, Cat2, Ag, غلوكوز إيزوميراز المنتج من يكتريا roseiscleroticus M14 ، ووجد أن الفعالية العظمى للإنزيم كانت عند درجة الحرارة 60 س و الرقم الهيدروجيني 7 و تركيز 0.8 مول من الركيزة (الغلوكوز) وقد بقي الأنزيم مستقراً ضمن مجال درجة الحرارة 60-30 مم والرقم الهيدروجيني 9-7 كما تبين أن الشوارد المعدنية (Mg Co Ca Mn) أثرت إيجابياً على نشاط إنزيم غلوكوز إيزوميراز، بينما لعبت شوارد (Cu, Ag, g) دوراً مثبطاً له وكان أفضلها في تنشيط الإنزيم مزيج من شوارد الكوبالت والمغنزيوم.أجريت مراحل التنقية لإنزيم غلوكوز إيزوميراز بدءاً من الترسيب بملح كبريتات الأمونيوم Sephacryl S-200 ثم عمود Sephadex G-100 ثم باستخدام عمود الكروماتوغرافيا بينت نتائج التنقية ارتفاع الفعالية الإنزيمية التي بلغت 15.1 وحدة مل، كما بلغت الفعالية النوعية 32.3 وحدة مع وبعدد مرات تنقية بلغت 3 وبحصيلة إنزيمية مقدارها 11.6% وباستخدام الرحلان الكهربائي هلامة SDS-PAGE أمكن حساب الوزن الجزيئي للإنزيم المدروس والذي بلغ 48 كيلو دالتون. استخدم إنزيم غلوكوز إيزوميراز الخام المنتج من العزلة المحلية S.roseiscleroticus Mt4 في تحويل الغلوكوز إلى الفركتوز في كل من الغلوكوز النفي وشراب غلوكوز الذرة وتبين تحول الغلوكوز إلى الفركتوز خلال 45 ساعة.