عزل وتنسيل وتعبير مورثة Hrp N من البكتيريا Erwinia amylovora وتقييم فعالية الهاربين بتحريض بعض ردود الفعل الدفاعية على نبات القمح

Abstract

أجري البحث في مخبر أمراض النبات البكتيرية - كلية الزراعة، ومخبر البيولوجيا الجزيئية في الهيئة العامة للتقانة الحيوية بدمشق، استخدم في هذه الدراسة بروتين الهاربين المؤشب Harpine مصدره الأساسي بكتيريا Erwinia amylovora المسببة للفحة النارية على التفاحيات، حيث أجري تنسيل المورثة HrpN المسؤولة عن إنتاج البروتين في هيئة الطاقة الذرية إلى البلاسميد Pmal C2 بعد تعديله أدخل إلى سلالة التحوير Escherichia coli DH5 أجريت اختبارات التأكد من صحة الإدخال ومن ثم عزلت البلاسميدات المحورة وأدخلت إلى سلالة التعبير E.coli BL21 ، وتم الحصول على البروتين الكلي الذي أجري تنقية بروتين الهاربين منه باستخدام عمود amylose resin اختبرت نقاوة الهاربين المنتج وقيست تراكيزه باستخدام الرحلان على هلامة SDS-PAGE، وظهر بالرحلان حزمة واضحة ذات وزن جزيئي تقديري 44 كيلو دالتون وهو الوزن الجزيئي لبروتين الهاربين الخاص بـ E.amylovora. كما اختبرت الثباتية الحرارية للهاربين باعتبارها إحدى أهم صفات الهاربين، حيث عرض بروتين الهاربين لدرجات حرارة مختلفة (30) 45 ، 60، 70، (80) س لخمس دقائق، بعدها حقن في أوراق التبغ بعد تبريده لدرجة حرارة الغرفة، وروقبت ردة فعل فرط الحساسية على التبغ، حيث أظهرت النتائج ظهور ردة فعل فرط حساسية على أوراق التبغ مما يدل على الثباتية الحرارية للبروتين. طبق بروتين الهاربين Harpin المؤشب على بادرات قمح بعمر 10 أيام، لدراسة تأثيره في تحفيز المقاومة في القمح من خلال قياس فعالية أنزيم SOD) superoxide dismutase) واستخدم الماء المقطر المعقم كشاهد أخذت العينات بعد الرش على أزمنة متعددة (0، 1، 2، 4، 18 ، 24، 48، 72 (96) ساعة وحفظت في التجميد على - 70 من لحين إجراء الاختبارات، حيث عزل البروتين الكلي من العينات المحفوظة على شكل خلاصات بروتينية وقدرت تراكيزها بطريقة برادفورد، ومن ثم قيست الفعالية الأنزيمية لأنزيم سوبر كسيد دسموتاز SOD) Superoxide dismutase) بواسطة جهاز المطياف الضوئي، وأظهرت النتائج زيادة فعالية أنزيم الـ SOD في بادرات القمح المعاملة ببروتين الهاربين مقارنة بالمعاملة بالماء المقطر؛ فبدأت الزيادة الملحوظة في فعالية الأنزيم من الساعة الـ 18 بعد الرش وازدادت الفعالية حتى بلغت أعلى تركيز للأنزيم بعد 96 ساعة من الرش حيث وصلت إلى 2.68 مرة من تركيز الأنزيم في عينات الشاهد، كذلك أجري رحلان Native-PAGE للعينات المعاملة بالهاربين والمعاملة بالماء للأزمنة المختلفة وكشف عن الأنزيم عن طريق الحزم الشفافة التي تظهر نتيجة منافسة الأنزيم للـ NBT) Nitro Blue Tetrazolium) وبينت النتائج ازدياد كثافة هذه الحزم في العينات المعاملة بالهاربين الأزمنة حصاد 18 ، 24، 48، 72 96 ساعة بعد الرش مقارنة بالعينات المعاملة بالماء لهذه الأزمنة والتي بقيت كثافتها على نفس الدرجة تقريباً، كما درس التعبير المورثي المورثة zn-SOD ولمورثة الأكتين كشاهد داخلي عن طريق إجراء PCR- والرحلان على هلامة الأغاروز، وكانت النتائج مؤكدة لما سبق حيث تزايدت كثافة حزم الـ zn-SOD في العينات المرشوشة بالهاربين تدريجياً في العينات، وكانت أعلى كثافة حزمة عند زمن حصاد 96 ساعة بعد المعاملة بالهاربين مقارنة بالشاهد المعامل بالماء، أما تعبير مورثة الاكتين بقي كما هو تقريباً في العينات المعزولة من نباتات القمح سواء المعاملة بالهاربين أو المعاملة بالماء، مما يدل بأن أن لبروتين الهاربين فعالية على تحريض أنزيم الـ SOD على مستوى النسخ أي أنه أدى الزيادة التعبير عن المورثة المسؤولة عن أنزيم الـ SOD. كذلك قيمت كفاءة رش بادرات القمح ببروتين الهاربين المؤشب Harpine في زيادة فعالية أنزيم البيروكسيداز (POD)، وذلك عن طريق قياس الفعالية الأنزيم إعتماداً على طريقتي المطياف الضوئي والرحلان الكهربائي على هلامة متعدد الأكريل أمايد ( native PAGE)، أظهرت نتائج القياس بالمطياف الضوئي زيادة في فعالية أنزيم البيروكسيداز في الأنسجة النباتية لأوراق القمح المعاملة ببروتين الهاربين مقارنة بالمعاملة بالشاهد (الماء)، كانت الزيادة تدريجية وبلغت أعلى تركيز للأنزيم بعد 72 ساعة بعد معاملة الرش بالهاربين مقارنة بالشاهد حيث بلغت 1.828 ضعف معاملة الشاهد، ثم انخفضت قليلا في الزمن 96 ساعة بعد الرش، وأكد ذلك الكشف عن فعالية أنزيم POD عن طريق إجراء رحلان كهربائي متعدد الأكريل أمايد (Native-PAGE) للخلاصات البروتينية للعينات المدروسة، فبينت نتيجة الرحلان ازدياد كثافة وشدة حزم البيروكسيداز تدريجيا في العينات المعاملة بالهاربين ووصلت لأعلى فعالية أعلى كثافة وشدة للحزمة الناتجة في الزمن 72 ساعة بعد الرش ثم انخفضت كثافة الحزمة قليلاً في زمن الحصاد 96 سا بعد المعاملة، كما أجريت دراسة للتعبير المورثي المورثة GPX إحدى المورثات المسؤولة عن أنزيم البيروكسيداز وقورنت بتعبير مورثة Tab actin (الشاهد الداخلي) على هلامة الأغاروز، وأظهرت النتائج ثباتية نسبية في التعبير مع الزمن لكلا المورثتين سواء في بادرات القمح المعاملة بالماء أو البادرات المعاملة ببروتين الهاربين أي لم يظهر تأثير المعاملة القمح ببروتين الهاربين على التعبير المورثي لمورثة GPX ، مما يدل على أن تأثير بروتين الهاربين بتحريض انتاج أنزيم البيروكسيداز ليس على مستوى النسخ، وربما هناك مورثات أخرى تلعب دورا في زيادة نشاطه كما درس تأثير الهاربين في رفع تركيز الفلافونيدات الكلية بطريقة كلوريد الألمنيوم اللونية، وتبين ازدياد التركيز عند المعاملة بالهاربين حتى بلغ ضعف التركيز تقريباً في معاملة الشاهد عند زمن حصاد 96 سا بعد المعاملة. كذلك قيم تأثير بروتين الهاربين في نمو نبات القمح، حيث أخذت قراءات نسبة الإنبات وطول الجذير والسويقة وعدد الجذور والوزن الرطب والجاف وتركيز الكلورفيل في البادرات كمؤشرات أولية لقوة النمو؛ وبينت التجربة وجود تأثير معنوي للهاربين في طول الجذير والسويقة في بادرات القمح بعمر أسبوع (153.95 ، 170.03) مم على التوالي مقارنة بالشاهد الماء (102.27) ، (131.84) مم ، ورافق زيادة الطول للسويقة والجذير زيادة معنوية في متوسط الوزن الرطب والجاف لبادرات القمح المعاملة بالهاربين حيث كان (1.20، 1.27) على التوالي ضعف الوزن الرطب والجاف للبادرات المعاملة بالشاهد الماء، وبنفس الوقت ازدادت كمية اليخضور معنويا من 11.2 مغ / غ نبات في الشاهد إلى 14.2 مغ / غ في البادرات المعاملة بالهاربين. من جهة أخرى قيم تأثير بروتين الهاربين في تحفيز مقاومة القمح لمرض عفن جذور القمح واستخدمت عزلات ممرضة تنتمي للأجناس ( Fusarium, Pythium, Rhizoctonia) لعدوى الصنف بحوث 5 القابل للإصابة بالمرض، وقورن الهاربين بالماء كشاهد أول ومعقم البذار دايفنكونازول كشاهد ثان. أظهرت النتائج أن بروتين الهاربين أعطى فعالية بتحفيز مقاومة القمح للإصابة بأعفان الجذور الثلاثة المدروسة مقارنة بالشاهد الماء وكانت فعاليته ضد فطر Fusarium مماثلة لمعقم البذار دايفنكونازول (درجة إصابة (0) وتفوق على معقم البذار المستخدم عند العدوى بالفطر Pythium حيث معاملة الهاربين أدت لدرجة إصابة 0 بينما معاملة معقم البذار أظهرت درجة إصابة 1، بينما كان المعقم أفضل منه عند العدوى بالفطر Rhizoctonia وأخيراً درست فعالية بروتين الهاربين في الحد من إمراضية بكتيريا تخطط الأوراق البكتيري على القمح Xanthomonas translucens ، استخدم في الدراسة عزلتين للممرض X10 و Xt4.2 والصنف شام 6 القابل للإصابة. أظهرت معاملة الهاربين انخفاض في نسبة شدة الإصابة بالعزلتين إلى (14.8 13.2) % على التوالي مقارنة بالشاهد ؛ حيث بلغت نسبة شدة الإصابة بالعزلة %10 6.4 في بادرات القمح المعاملة بالهاربين مقارنة بالشاهد الذي بلغت فيه نسبة شدة الإصابة 43.2%، بينما بلغت في البادرات المعدية بالعزلة 14.2 (5.2 39.2 بالنسبة للبادرات المعاملة بالهاربين والماء على التوالي، اقترن انخفاض شدة الإصابة بالعزلتين بانخفاض في النمو البكتيري في الأنسجة؛ حيث بدأ الانخفاض في التعداد البكتيري للعزلتين بعد 72 ساعة من العدوى فكان التعداد أقل بـ 50 مرة في النباتات المعاملة بالهاربين مقارنة بالشاهد للعزلة Xt10 و أقل ب 120 مرة بالنسبة للعزلة X4.2 واستمر انخفاض التعداد البكتيري لبعد 99 ساعة من العدوى بالعزلتين الممرضتين X10 و Xt4.2، وبذلك يكون بروتين الهاربين قد أثبت فعالية في الحد من إمراضية وتخطط الأوراق البكتيري على القمح.