تحديد وعزل بعض المورثات المسؤولة عن تحسين تحمل الاجهاد الحلولي لدى بعض الطرز الوراثية من الشعير (Hordeum vulgare l ).

Abstract

XIV

الملخص العربي

نفذ البحث خلال الموسم الزراعي 2018 2019م في مزرعة أبي جرش - كلية الزراعة - دمشق، وفي مخبر المحاصيل الحقلية ومخبر التقانات الحيوية التابع لقسم المحاصيل الحقلية - كلية الزراعة، جامعة دمشق، نفذت الدراسة على خمسة عشر طرازاً وراثياً من الشعير (فرات 4 فرات ، فرات 6، فرات 7 فرات 9، عربي أسود أبيض محسن 14 16 10 13 18 H19)، بالإضافة إلى نوعين بربين من الجنس H.vulgare5564 والجنس .H.Spontaneum، تحت ظروف الزراعة المخبرية والحقلية، بهدف تقويم استجابة بعض طرز الشعير المدروسة للإجهاد الحلولي Osmotic stress عند مستوى البادرة الفتية باستعمال تقالة الغربلة المخبرية السريعة، بالإعتماد على تقانة الاستجابة للتحريض الحلولي، ودراسة أهمية التحريض في تحسين تحمل البادرات للمستويات المميتة من الإجهاد الحلولي ونفذت دراسة حقلية على تسعة طرز وراثية متحملة متوسطة التحمل، حساسة، بناءاً على نتائج الدراسة المخبرية، وذلك لتقويم نتائج الدراسة المخبرية وتقويم أداء الطرز الوراثية المدروسة نفسها في البيئات المجهدة مائياً تحت ظروف الزراعة المطرية)، بالاعتماد على بعض الصفات التطورية والفيزيولوجية، والبيوكيميائية المرتبطة وراثياً بالتحمل، وأدخلت في الدراسة الوراثية لدراسة التنوع الوراثي، وتحديد درجة القرابة الوراثية بينها وبين الطرز الوراثية المزروعة باستعمال تقنية SSR ، كما تمت دراسة التباينات الأليلية لمورثات الديهيدرين والدريب (DREBS DINS) المسؤولة عن تحمل الجفاف، على مستوى الحمض النووي DNA وتحديد مواقع هذه المورثات، ثم عزلت بعض المورثات المدروسة ودرس التتابع النيوكلوتيدي لها.

بينت نتائج التجربة المخبرية إن معاملة المستوى الحلولي المميت . ) كانت بمنزلة المستوى الحلولي المميت الأمثل، والمعاملة (4) بمنزلة المستوى الحلولي المحرض الأمثل. ولوحظ إن متوسط طول الجذور والبادرات كان الأعلى معنوياً في البادرات المحرضة (9.81، 18.70 سم على التوالي)، في حين كان متوسط طول الجذور والبادرات الأدنى معنوياً لدى البادرات غير المحرضة، التي نقلت مباشرة إلى المستوى الحلولي المميت (6.73 11.02) سم على التوالي). وكانت نسبة الانخفاض في طول كل من الجذور والبادرات الأعلى معنوياً لدى البادرات غير المحرضة (62.26)

1

%67.96 على التوالي بالمقارنة مع البادرات المحرضة 43.78 45.80% على التوالي)، ما يشير إلى أهمية التحريض في تحسين كفاءة البادرات على تحمل المستويات المميتة من الإجهاد الحلولي.

بينت نتائج التحليل الإحصائي للتجربة الحقلية عدم وجود فروقات معنوية (0.05 > p) في صفة متوسط عدد الأيام حتى الإزهار بين الطرز الوراثية المدروسة، في حين لوحظ وجود فروقات معنوية (0.05 > p) في متوسط صفة ارتفاع النبات والمساحة الورقية بين الطرز الوراثية المدروسة. وكان متوسط ارتفاع النبات الأعلى معنوياً لدى الطرز الوراثية أبيض محسن H13، فرات وبدون فروقات معنوية بينها (93.4 83.20، 82.63 سم على التوالي، في حين كان الأدنى معنوياً لدى الطراز الوراثي 69.13119 سم، تلاه وبفروقات معنوية الطراز الوراثي 1118 76.47 سم). في حين كان متوسط المساحة الورقية الأعلى ظاهرياً لدى الطراز الوراثي 19 عربي أسود (90.4، 88.2 سم نبات على التوالي)، في حين كان الأدنى ظاهرياً لدى الطرز H13، أبيض محسن (73.9، 78.3 سم -نبات على التوالي. وبينت نتائج التحليل الإحصائي وجود فروقات معنوية (0.01 > p) في متوسط۷:۳۹ مستوى المادة الفتيان باستعمال تقانة الغربلة المخبرية السريعة، بالاعتماد على الثقافة الاستجابة للتحريض ٩٤

الحلولي، ودراسة أهمية التحريض في تحسين تحمل البادرات للمستويات المميتة من الإجهاد الحلولي، ونفذت دراسة حقلية على تسعة طرز وراثية متحملة متوسطة التحمل، حساسة، بناءاً على نتائج الدراسة المخبرية، وذلك لتقويم نتائج الدراسة المخبرية وتقويم أداء الطرز الوراثية المدروسة نفسها في البيئات المجهدة مانياً (تحت ظروف الزراعة المطرية، بالاعتماد على بعض الصفات التطورية والفيزيولوجية، والبيوكيميائية المرتبطة وراثياً بالتحمل، وأدخلت في الدراسة الوراثية لدراسة التنوع الوراثي، وتحديد درجة القرابة الوراثية بينها وبين الطرز الوراثية المزروعة باستعمال تقنية SSR ، كما تمت دراسة التباينات الأليلية لمورثات الديهيدرين والدريب (DREBS DHNS) المسؤولة عن تحمل الجفاف، على مستوى الحمض النووي DNA وتحديد مواقع هذه المورثات، ثم عزلت بعض المورثات المدروسة ودرس التتابع النيوكلوتيدي لها.

بينت نتائج التجربة المخبرية إن معاملة المستوى الحلولي المميت (Mpa ) كانت بمنزلة المستوى الحلولي المميت الأمثل، والمعاملة 0.4 ) بمنزلة المستوى الحلولي المحرض الأمثل. ولوحظ إن متوسط طول الجذور والبادرات كان الأعلى معنوياً في البادرات المحرضة (9.81، 18.70 سم على التوالي)، في حين كان متوسط طول الجذور والبادرات الأدنى معنوياً لدى البادرات غير المحرضة، التي نقلت مباشرة إلى المستوى الحلولي المميت (6.73 11.02) سم على التوالي). وكانت نسبة الانخفاض في طول كل من الجذور والبادرات الأعلى معنوياً لدى البادرات غير المحرضة (62.26)

1

%67.96 على التوالي بالمقارنة مع البادرات المحرضة 43.78 45.80% على التوالي، ما يشير إلى أهمية التحريض في تحسين كفاءة البادرات على تحمل المستويات المميتة من الإجهاد الحلولي.

بينت نتائج التحليل الإحصائي للتجربة الحقلية عدم وجود فروقات معنوية (0.05 > p) في صفة متوسط عدد الأيام حتى الإزهار بين الطرز الوراثية المدروسة، في حين لوحظ وجود فروقات معنوية (0.05 > p) في متوسط صفة ارتفاع النبات والمساحة الورقية بين الطرز الوراثية المدروسة، وكان متوسط ارتفاع النبات الأعلى معنوياً لدى الطرز الوراثية أبيض محسن H13 فرات 6 وبدون فروقات معنوية بينها (93.4 83.20 82.63 سم على التوالي، في حين كان الأدنى معنوياً لدى الطراز الوراثي 69.1319 سم، تلاه وبفروقات معنوية الطراز الوراثي 76.4718 سم). في حين كان متوسط المساحة الورقية الأعلى ظاهرياً لدى الطراز الوراثي H19 عربي أسود (90.4، 88.2 سم نبات على التوالي)، في حين كان الأدنى ظاهرياً لدى الطرز H13 أبيض محسن (73.9)، 78.3) سم . نبات على التوالي). وبينت نتائج التحليل الإحصائي وجود فروقات معنوية (0.01 > p) في متوسط صفة نسبة تسرب الذائبات، وصفة متحوى الماء النسبي في الأوراق، وصفة محتوى البرولين في الأوراق بين الطرز الوراثية المدروسة. كان متوسط نسبة الذائبات المتسربة على الأغشية السيتوبلاسمية الأعلى معنوياً لدى الطرازين الوراثيين H10، فرات 7 (79.25 78.72% على التوالي) وبدون فروقات معنوية بينها، في حين كان الأدنى معنوياً لدى الطرز عربي أسود 184 70.61 72.93% على التوالي) وبدون فروقات معنوية بينها و كان متوسط محتوى الماء النسبي في الأوراق كان الأعلى معنوياً لدى الطرز الوراثية 18، 19، وعربي أسود (76.94) 74.92، 74.36% على التوالي وبدون فروقات معنوية بينها، في حين الأدنى معنوياً لدى الطرز فرات 6، 13 ، وفرات 7 (64.6، 63.56، 56.44 % على التوالي وبدون فروقات معنوية بينها. ولوحظ إن متوسط محتوى البرولين في الأوراق كان الأعلى معنوياً لدى الطرز فرات 1394 (4.383 4.273 ميكرو غرام. غ-1 مادة خضراء على التوالي) وبدون فروقات معنوية بينها، في حين كان الأدنى معنوياً لدى الطرازين أبيض محسن و 10 (1138)

1.781 ميكرو غرام غ مادة خضراء على التوالي).

لوحظ وجود علاقة ارتباط موجبة ومعنوية جداً بين صفة ارتفاع النبات وعدد الأيام اللازمة للإزهار۳۹ فروقات الكوية بينية في حين كان الأدنى معنوياً لدى الطرازين أبيض محل و 13816

1.781 ميكرو غرام غ مادة خضراء على التوالي).

4

لوحظ وجود علاقة ارتباط موجبة ومعنوية جداً بين صفة ارتفاع النبات وعدد الأيام اللازمة للإزهار

2

(0.67 )، حيث تؤدي زيادة طول النباتات إلى تأخر حدوث الإزهار. ولوحظ وجود علاقة ارتباط موجبة و معنوية بين صفة محتوى الماء النسبي ومحتوى البرولين في النبات (0.29 = 1)، ولوحظ وجود علاقة ارتباط سالبة ومعنوية بين نسبة الذائبات المتسربة عبر الأغشية السيتوبلاسمية ومحتوى الأوراق من البرولين (0.47 - )، حيث تؤدي الذائبات العضوية دوراً مهماً في المحافظة على ترطيب البروتوبلاسم، والمحافظة على محتوى الماء النسبي في خلايا الأوراق، ولوحظ وجود علاقة ارتباط سلبية ومعنوية بين صفة ارتفاع النبات مع صفة محتوى الماء النسبي في الأوراق (0.44- = ) ، ويُعزى ذلك إلى إن زيادة حجم المسطح الورقي الأخضر المعرض مباشرة لأشعة الشمس تؤدي إلى زيادة فقد الماه بالنتح، كما لوحظ وجود علاقة ارتباط سالبة ومعنوية بين صفة محتوى الماء النسبي في الأوراق ونسبة الذائبات المتسربة عبر الأغشية السيتوبلاسمية ( 0.26 = 1، حيث يؤدي تراجع محتوى الخلايا النباتية الماني تحت ظروف الإجهاد الحلولي (التأثير الحلولي إلى زيادة مقدار الضرر الحاصل في الأغشية السيتوبلاسمية، لذلك تعد عملية المحافظة على محتوى الماء النسبي في الأوراق من الصفات الفيزيولوجية المهمة المرتبطة مع المحافظة على سلامة الأغشية السيتوبلاسمية، ومن ثم نسبة الخلايا النباتية الحية، والمقدرة على استعادة النمو.

في الدراسة الوراثية التي أجريت لتحديد درجة القرابة الوراثية بين طرز الشعير المدروسة المزروعة باستعمال تقنية SSR، حيث استخدم لهذا العرض 14 زوجاً من البادئات، أثبتت فعاليتها في إعطاء تعددية شكلية بين الطرز الوراثية المدروسة، ونجم عن استعمالها 19 حزمة، تراوح عدد الحزم لكل زوج بادئة بين حزمة واحدة كأقل عدد مع أزواج البادئات، و 3 حزم كأعلى عدد مع زوج البادئة (Bmagonos)، بمتوسط 4.6 حزمة لكل بادئة. وبلغ متوسط النسبة المئوية للتعددية الشكلية 100% وقد تبين إن أقل قيمة المصفوفة التوافق (PAV) هي 0.318 بين الطرازين الوراثيين فرات 4 و H10 ما يدل على وجود تباين وراثي كبير بينهما، بينما كانت أعلى قيمة لمصفوفة التوافق A نحو 0.9090 بين الصنفين أبيض محسن وفرات 7، ما يدل على إنهما على درجة كبيرة من القرابة الوراثية. وتراوح متوسط معامل التعددية الشكلية (PIC) بين 0.320 إلى 0.721 بمتوسط 0.446، حيث أثينت البادئات المستخدمة قدرتها على

التمييز بين الطرز الوراثية المدروسة.

في دراسة التباينات الأليلية لمورثات DHNs و DREBS) المسؤولة عن بعض الصفات المرتبطة بتحسين تحمل الجفاف على مستوى الحمض النووي DNA، أظهرت الدراسة اختلافاً واضحاً في هذه

3

المورثات بين الطرر المدروسة، حيث كانت النباينات الشكلية في الوزن الجريني بين نظائر الموقع الواحد كبيرة أحياناً، وكانت على درجة كبيرة من التماثل في البعض الآخر، وأمكن تمييزها بسهولة على هلامة ميتفور أغاروز 4%، حيث أظهر تفاعل PCR بالنسبة لمورثات الديهيدرين Dhn3 ، Dhn 2 Din ، Din 10 ، Dhn Dhm5 وجود نمط شكلي واحد (۸۸) تباين في الظهور والغياب مع جميع الطرز الوراثية المدروسة، فيما أعطت المورثات Din12 ، Dhal 1 Dhn6 نمطين شكليين (A,B) تباينت عند الطرز الوراثية المدروسة، وظهرت ثلاثة إنماط شكلية (ABC) لمورثة الديهيدرين Dhn7 حيث ظهر النمط (۸) في جميع الطرز الوراثية وغاب عند الطراز الوراثي فرات 7، في حين ظهر النمط (B) في الصنف أبيض محسن وغاب عند بقية الطرز، وظهرت أربعة أنماط شكلية لمورثة الديهيدرين Din4٩٤

1261

التمييز بين الطرز الوراثية المدروسة.

في دراسة التباينات الأليلية لمورثات (DHNS و DREBS) المسؤولة عن بعض الصفات المرتبطة بتحسين تحمل الجفاف على مستوى الحمض النووي DNA، أظهرت الدراسة اختلافاً واضحاً في هذه

3

المورثات بين الطرز المدروسة، حيث كانت التباينات الشكلية في الوزن الجزيئي بين نظائر الموقع الواحد كبيرة أحياناً، وكانت على درجة كبيرة من التماثل في البعض الآخر، وأمكن تمييزها بسهولة على هلامة ميتافور أغاروز 4%، حيث أظهر تفاعل PCR بالنسبة لمورثات الديهيدرين Dhn3 Dhn2 Dhn1 ، Dhn 10 ، Dhn Dhn5 وجود نمط شكلي واحد (AA) تباين في الظهور والغياب مع جميع الطرز الوراثية المدروسة، فيما أعطت المورثات Dhn/2 ، Dhn 11 ، Dhn6 نمطين شكليين (A,B) تباينت عند الطرز الوراثية المدروسة، وظهرت ثلاثة إنماط شكلية (ABC) لمورثة الديهيدرين Dhn7 حيث ظهر النمط (A) في جميع الطرز الوراثية وغاب عند الطراز الوراثي فرات 7، في حين ظهر النمط (B) في الصنف أبيض محسن وغاب عند بقية الطرز، وظهرت أربعة انماط شكلية لمورثة الديهيدرين Dhn4 تباينت عند الطرز الوراثية المدروسة، أما بالنسبة لمورثات الـ DREB، فقد ظهر نمطاً شكلياً واحداً (AA) عند المورثات DREB7 DREB5 DREB2 DREB1 تباينت بالظهرو والغياب مع جميع الطرز الوراثية المدروسة، في حين ظهر نمطين شكليين ) عند المورثتين DREB4 ،DREB3 تباينت بالظهور والغياب مع الطرز الوراثية المدروسة.

أظهرت النتائج بالنسبة لمورثات الديهيدرين (Dhns) تفوق المورثة Dhn4 بعدد القرائن التي أعطتها والبالغة 20 قريناً شكلياً مع كافة الطرز المدروسة، تلتها المورثة DREB4 بنحو 18 قريناً شكلياً، في حين أعطت المورثتين Dhn11 و Dhn12 أقل عدد من القرائن (4) قرائن شكلية مع الطرز الوراثية المدروسة. أظهرت النتائج تفوق الطرازين الوراثيين H18 و H19 بعدد القرائن التي أعطتها والبالغة 12 و 11 قريناً شكلياً على التوالي، تلاهما الطرازين الوراثيين فرات 4 و عربي أسود بنحو عشرة قرائن شكلية، في حين أمتلك الطراز الوراثي فرات 7 أقل عدد من القرائن (3) قرائن شكلية)، تلاه الطراز الوراثي H10 والبالغة (4) قرائن شكلية). أما بالنسبة لمورثات (DREBS) تفوق المورثة DREB4 بعدد القرائن التي أعطتها ( 18 قريناً شكلياً مع كافة الطرز المدروسة، تلتها المورثة DREB2 (15) قريباً شكليا)، في حين أعطت المورثات DREB3 و DREBS و DREB7 أقل عدد من القرائن (5) قرائن شكلية مع الطرز الوراثية المدروسة. كما أظهرت النتائج تفوق الصنفين عربي أسود و فرات 4 بعدد القرائن التي أعطتها (12) و 11 قريناً شكلياً على التوالي، في حين أمتلك النوعان H.vulgare5564 و قرينين شكليين فقط H.spontaneum

تم تحديد التسلسل النيكلوتيدي لقطعة DNA الخاصة بالموقع الوراثي Dinl في الطرازين الوراثيين (H18 عربي أسود)، وتبين أنها تشابه (dehydrin (Dhn1 في نوع الشعير Hordeum) (spontaneum في بنك المعلومات بنسبة %99% و 98% على التوالي لكل من الطرازين الوراثيين (H18 وعربي أسود)، في حين كان الموقع الوراثي Dhn6 يشابه Hordeum Vulgare بنسبة 91% و 88

على التوالي لكل من الطرازين الوراثيين (H19) وفرات (4).1261

H.spontaneum قرينين شكليين فقط.

ثم تحديد التسلسل النيكلوتيدي لقطعة DNA الخاصة بالموقع الوراثي 1 Din في الطرازين الوراثيين (118) عربي أسود)، وتبين أنها تشابه (dehydrin (Dhn1 في نوع الشعير Hordeum) (spontaneum في بنك المعلومات بنسبة 99% و 98% على التوالي لكل من الطرازين الوراثيين (H18 وعربي أسود)، في حين كان الموقع الوراثي Dhn6 يشابه Hordeum Vulgare بنسبة 91% و 88 على التوالي لكل من الطرازين الوراثيين (H19) وفرات (4).

وتم رسم شجرة القرابة الوراثية المورثات الديهيدرين المسؤولة عن تحسين تحمل الجفاف اعتماداً على نتائج التسلسل التوكليوتيدي المورثتي Dhol و Dhn6 في الطرز الوراثية المدروسة (H18، عربي أسود، H19، فرات (4)، حيث ثم إدخالها في مواقع بنك المعلومات العالمي (NCBI)، حيث ثم استعمال البرنامج الإحصائي MEGA، ووجد إن المورثات المدروسة في الطرز الوراثية كانت على نفس الفرع للمورثات الموجودة في بنك المعلومات، وهذا يدل على إنه لم يحدث تغيير وراثي في هذه المورثات.

لوحظ وجود تأثير سلبي للمورثة (Dhn2) في صفتي المساحة الورقية وارتفاع النبات أثناء تعرضها للإجهاد المائي، بينما لوحظ لها تأثير إيجابي في صفة محتوى الماء النسبي في الأوراق، وتعد هذه المورثة من المورثات متعددة التأثير، في حين إن صفة ارتفاع النبات ارتبطت فيها أكثر من مورثة (DREB7) Dhn 12 ،DREB4 Dhn2)، وارتبطت صفة متوسط محتوى الماء النسبي في الأوراق بالمورثات (Dhn7) Dhn Dhn2 وتعد صفات معقدة يتحكم بها عدد من المورثات، وارتبطت المورثة Dhn9 مع صفة نسبة الذائبات المتسربة حيث كان لها تأثير سلبي، وأرتبطت المورثة Dhn6 مع صفة محتوى البرولين، حيث كان لها تأثير إيجابي في صفة محتوى البرولين أثناء تعرضها للإجهاد المائي، في حين لم يظهر ارتباط بعض المورثات الأخرى بالصفات المدروسة، ويُعزى ذلك إلى إن بعض المورثات قد ترتبط بصفات أخرى لم يتم دراستها في هذا البحث.

بينت النتائج إن طرز الشعير (118، H19 عربي أسود، وفرات (4) كانت أفضل الطرز الوراثية المدروسة من حيث المقدرة التكيفية والاستجابات الفيزيولوجية والبيوكيمائية تحت ظروف الجفاف، ويعود ذلك لامتلاكها أكبر عدد من القرائن المسؤولة عن تحمل الجفاف، وقد إنعكس ذلك في مستوى أدائها في الحقل، حيث تفوقت في أغلب الصفات الحقلية المدروسة على باقي الطرز الوراثية المدروسة.