انتاج بروتين الصدمة الحرارية البكتيري GroEl المؤشر ودراسة ارتباطه بالضد النانوي NbBruc02

Abstract

البروسيلا Brucella هي بكتريا ممرضة داخل خلوية اختيارية، لها أثر كبير على الصحة والثروة الاقتصادية في سوريا، الأمر الذي دعا إلى بذل الكثير من الجهد في سبيل تطوير الكواشف واللقاحات لمحاربتها. في هذا الصدد، تم في أعمال سابقة إنشاء مكتبة أضداد نانوية استمناعية واسعة ومنها عزل العديد من الأضداد النوعية للبروسيلا وكان من بينها الضد النانوي NbBruc02 الذي هو تعريفا الشدفة المتغايرة المهندسة وراثيا من ضد الجمل ذو السلسلة التقيلة. لدى تحديد المستضد النوعي لهذا الضد الثانوي بطرائق بروتيومية تبين أنه بروتين الصدمة الحرارية للبروسيلا ذو الوزن الجزيئي ٦٠ كيلود التون، أو ما يعرف اختصارا ب GroEL، وهذا البروتين هو واحد من المستضدات الاستمناعية للبروسيلا، ويلعب دورا هاما في دورة حياة الطفيلي وخاصة عمليتي الالتصاق والاختراق خلال عملية العدوى على البالغات الضخمة والبقاء على قيد الحياة في حويصلاتها الحالة.

في هذا العمل، تم التحقق من قدرة الضد الثانوي NbBruc02 على ربط مستضده النوعي متمثلا بالبروتين GroEL المؤشب المنتج بطرائق التنسيل والتعبير البروتيني في البلاسميد PHEN6. لهذه الغاية تم استخلاص الدنا الجينومي من بكتريا البروسيلا واليرسينيا بعد تحديد نقاوة السلالات باستخدام PCR متعدد الشدف multiplex PCR و انطلاقا من هذا الدنا ضخمت المورثة GroEL بواسطة تفاعل PCR، وذلك باستخدام مرنسات نوعية حاوية على موقعي قطع أنزيمات التقييد Xbal و BstEll في النهايتين 3 و 5 على التوالي بعدها تم ربط كلا من المورثة المقطوعة والبلاسميد المقطوع pHEN6، وحورت بكتريا Ecoli بناتج عملية التنسيل عبرت المستعمرات عن بروتين الصدمة الحرارية المؤشب 600 بالشكل المنحل ضمن فراغ البلاسما المحيطية بحيث تمكنا من تنقيته باستخدام الكروماتوغرافيا ذات الألفة الشاردية، وقد أثبتنا نقاء البروتين المؤشب بترحيله على هلامة عديد الأكريلاميد والكشف عنه إما بتلوينه بواسطة صبغة الكوماسي أو بطريقة تلطخ وستن باستخدام أضداد نوعية للذيل الهستيديني His

أبدى الضد النانوي NbBruc02، بصورة مثير للاهتمام، قدرة كبيرة على الارتباط بالشكل السوي والممسخ للبروتين GroEL المؤشب للبروسيلا كما أظهرته طريقتي التبصيم والمقايسة المناعيتين. وبما يتفق مع نتائج سابقة، فقد أظهر هذا الضد النانوي قدرة على كشف بروتين الصدمة الحرارية الممسخ لليرسينيا أيضا، في حين أظهر نظام التحسس الحيوي بتقنية الرنين السطحي البلازمي قدرة ارتباط عالية، بثابت آلفة نانومولية (10) ، بين الضد النانوي ومستضده السوي من البروسيلا وليس من اليرسينيا، نظراً لكون تغيرات البنية الفراغية لبروتين الصدمة الحرارية تمثل أساس أدائه لوظيفته، فإن استثمار الضد النانوي NbBruc02 من خلال ربطه المعينته المستضدية الفراغية، يمكن أن يفتح آفاق واسعة لدراسة الدور الذي يضطلع به GroEL في فيزيولوجية البروسيلا، وإمكانية استثمار ذلك في تطوير آفاق علاجية جديدة.

الكلمات المفتاحية:

البروسيلا، البرسينيا، الأضداد الثانوية، بروتين الصدمة الحرارية التعبير البروتيني، نظام الرنين السطحي البلازمي