إنتاج إنزيم التاناز وحمض الغاليك من البكتيريا باستخدام مخلفات نباتية وتطبيقه في بعض الصناعات الغذائية

Abstract

جمعت 54 عينة عشوائية من مصادر مختلفة تربة، تقل زيتون زيتون مخلل، مخلل، مكدوس من محافظات مختلفة دمشق حمص اللاذقية السويداء، عزل منها 60 عزلة بكتيرية، غربات العزلات من حيث قدرتها على إنتاج إنزيم التاناز غربلة أولية بتنميتها على أطباق بتري حاوية على وسط الأغار المغذي مضافا له حمض التانيك 0.5%، واختيرت العزلات ذات القدرة على إنتاج الإنزيم من خلال تلون بني دليل على إنتاجها إنزيم التاناز فكانت 30 عزلة بكتيرية منتجة للإنزيم، ثم أجريت غربلة ثانوية لتحديد العزلة الأكثر كفاءة في إنتاج إنزيم التاناز من خلال تقدير الفعالية الإنزيمية بقياس الامتصاصية عند طول موجة 520 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي بينت النتائج تباين قدرة العزلات المدروسة في إنتاج إنزيم التاناز وأظهرت العزلة T13 المعزولة من عينة تربة من مزرعة زيتون في محافظة اللاذقية بأعلى فعالية إنزيمية مقارنة بباقي العزلات في حين تميزت العزلة 130 المعزولة من عينة تقل زيتون من محافظة السويداء بأقل فعالية إنزيمية شخصت العزلة T13 على أنها تابعة لنوع Bacillus licheniformis اعتماداً على دراسة بعض الصفات الشكلية والمجهرية وبعض الاختبارات الكيميائية الحيوية باستخدام صفيحة اختبار من نوع Microgen Bacillus ID kit. ثم تمت مقارنة مجموعة من المخلفات النباتية الغنية بالتانينات تقل العنب تقل الزيتون، تقل الشاي قشور الرمان قشور الموز في إنتاج إنزيم التاناز وحمض الغاليك لاستخدامها كركائز، حيث قيست كمية التانينات في الركائز المدروسة كحمض تانيك، واستخدمت هذه الركائز بنسبة 2% كحمض تانيك من حجم وسط التخمير السائل . أجريت عملية التخمير عند درجة حرارة 30 م لمدة 48 ساعة في حاضة هزازة بسرعة تهوية 200 داد وقيست كل من الفعالية الإنزيمية لإنزيم التاناز و كمية حمض الغاليك المتحررة في وسط التخمر خلال فترة التحضين لتحديد الركيزة الأفضل. تفوق تقل الشاي معنوياً كركيزة مقارنة بباقي الركائز يليها قشور الرمان وتقل الزيتون وقشور الموز وتقل العنب بالترتيب، حيث أعطى تقل الشاي أعلى فعالية إنزيمية بلغت 141.56 نانومول / مل (0.141) وحدة مل) وأعلى معدل لإنتاج حمض الغاليك 117.23 pg/ml. في حين أعطى تقل العنب أقل فعالية إنزيمية بلغت 9.8 نانو مول مل (0.09 وحدة / مل)، وأقل معدل الإنتاج حمض الغاليك 25.23 pg/ml. لذا تم اختيار تقل الشاي كركيزة لمتابعة عملية أمثلة ظروف إنتاج إنزيم التاناز.حددت الظروف المثالية لإنتاج التاناز وحمض الغاليك عند استخدام تصميم RSM في عملية الإمثلة فكانت كالتالي درجة الحرارة 35م، pH مدة التحضين 48 ساعة سرعة التهوية 150 دورة الدقيقة، تركيز تقل الشاي 1.5%. درست الصفات الفيزيوكيميائية للإنزيم الخام الناتج من حيث عدة عوامل مؤثرة على فعاليته كدرجة الحرارة ورقم الحموضة pH وتأثير بعض الشوارد المعدنية وتحمل الملح. كانت الفعالية العظمي للإنزيم عند درجة حرارة 40م، ورقم حموضة 5 كما بقى الإنزيم مستقرا ضمن مجال درجات الحرارة 30-40م لمدة 30 دقيقة أرقام حموضة 4-6 لمدة 30 دقيقة، وبينت النتائج أن شوارد المغنزيوم + Mg لعبت دوراً منشطاً لعمل الإنزيم حيث ازدادت فعالية الإنزيم بنسبة 50%، أما شوارد الحديد والحديدي فقد لعبت دوراً مثبطاً حيث انخفضت الفعالية الإنزيمية بنسبة 94.5% و 93.8% على التوالي، وقد احتفظ الإنزيم بفعاليته عند حفظه في محلول كلور الصوديوم بتراكيز مختلفة من احتى 1.5 M بدرجة حرارة 4 م لمدة 24 ساعة وانعدمت الفعالية عند تركيز M5 تم تنقية التاناز جزئياً بخطوتين بالترسيب بملح كبريتات الأمونيوم بتركيز 80% ثم استخدام عمود الترشيح الهلامي 75-SephadexG حيث كانت الحصيلة للإنزيم المنقى 12.4% وبلغت عدد مرات التنقية 3.16 مرة. تم تحديد الوزن الجزئيي لبروتين إنزيم التاناز باستخدام SDS-PAGE وبلغ 48 كيلو دالتون كما أمكن معاملة كل من عصير الرمان ومستخلص الشاي والنبيذ بإنزيم التاناز وكانت أفضل معاملة بإضافة الإنزيم بتركيز 2 مل / 10 مل لمدة 90 دقيقة وبلغت نسبة التانينات المزالة من كل منها 38% و 40% و 18% على التوالي.