إنتاج البروتياز الفطري بالطرائق الحيوية واستخدامه في صناعة الأجبان

Abstract

جمعت 45 عينة من التربة المحلية، حصل منها على ست عزلات فطرية شخصت انتخبت العرلة الأتفاً في ،khizomucor miehei (Cooney et Emerson) Schipper من النوع إنتاج البروتياز وزمرت بـ Rm4 حددت الظروف المثلى لإنتاج البروتياز من العزلة Rma باستخدام منهجية الاستجابة السطحية بعد الغربلة الأولية المكونات وسط التخمير. وقد تمثلت الظروف المثلى للإنتاج بالتخمير بالحالة السائلة في اختيار الجلوكوز والكازئين كمصدرين للكربون والنتروجين بالتراكيز 39.09 و 10.241 على التوالي، وضبط الـ pH الابتدائي عند 5.99، والتحضين عند درجة حرارة 40.9 ، لمدة 89.94 ساعة. كما تمثلت الظروف المثلى للإنتاج بالتخمير بالحالة الصلبة في اختيار نخالة القمح كركازة بمحتوى رطوبي 80% ومدعمة بالكازئين بنسبة 1.33%، وضبط الـ pH الابتدائي عند 6.31، والتحصين عند درجة حرارة 41.1 لمدة 81.21 ساعة. وقد بلغت قيم نشاط التخثر النوعي، ونسبة نشاط التختر / النشاط الحال للبروتين للمستخلص الأنزيمي المنتج بالتخمير السائل تحت الظروف المثلى 303.7 و 314.30 على التوالي بينما بلغت في المستخلص الأنزيمي المنتج بالتخمير الصلب 441.90mg ، و 388.66 على التوالي.

أجري التطفير لتحسين إنتاج البروتياز بالمعاملة بإيثيل سلفونات الميثان، والأشعة فوق البنفسجية، والأمواج الميكروية وفق جرعات مختلفة. وقد أظهرت الطفرة المحدثة بالتعريض للأمواج الميكروية ( 2450) لمدة 1500 تفوقها على باقي الطفرات الناتجة وفق جميع المؤشرات، إذ أظهر البروتياز المنتج تحسناً بمقدار 3.68 1.98 2.18 ضعفاً في كل من نشاط تخثر الحليب الكلي، ونشاط التخثر النوعي، ونسبة نشاط التخثر / النشاط الحال للبروتين على التوالي بالمقارنة مع أنزيم العزلة الأصل. كما أظهرت هذه الطفرة ثباتاً في قدرتها على إنتاج البروتياز لمدة 8 أجيال، وقد رمزت بـ MW150 أجريت التنقية الجزئية لبروتياز العزلتين الأصل والمطفرة بدءاً من الترسيب بسلفات الأمونيوم، ثم باستخدام عمود الترشيح الهالمي 100-Sephadex G. وقد أدت خطوات التنقية إلى ارتفاع الفعالية النوعية لأنزيم العزلة Rm4 بمقدار 8.5 أضعاف، وبمردود 4.9% كما ازدادت الفعالية النوعية الأنزيم العزلة MW150 بمقدار 19. أضعاف، وبمردود 4.01% وباستخدام تقنية الرحلان الكهربائي (SDS-PAGE) قدر الوزن الجزيئي للبروتياز المنقى المنتج من كل من العزلتين Rm4 بحوالي 39.77 ، و 40.62 على التوالي MW150 و

تقاربت الخواص الحركية لكل من الأنزيم الطبيعي والمطفر المنقيين، إذ تحقق أقصى نشاط لتخثر الحليب عند درجة حرارة 57.5 ، و 5 pH، وتركيز 9 من كلوريد الكالسيوم. كما تحققت أعلى قيم للنشاط الحال للبروتين عند درجة حرارة 57.5 و pH4. وكانت الأنزيمات مستقرة في المجال الحراري 50-40 لمدة 48 ، كما استقرت نسبياً عند الدرجات 60 و 70 لمدة 3 m 105 min و m 10min على التوالي، وتبطت عند التعرض للدرجتين السابقتين الفترات أطول. وكان الأنزيم مستقراً اتجاه التغير في قيم الـ pH ضمن المجال 7-3 pH وتمثل أثر كلوريد الصوديوم في تحفيز نشاط تختر الحليب وتثبيط النشاط الحال للبروتين. وبلغت قيمة ثابت ميكاليس .. والسرعة القصوى Vimeo البروتياز العزلة Rm4 اتجاه الكازئين mg/ml 19.46 و mg 0.0026mg/min على التوالي بناء على حساب النشاط التحللي، كما بلغت قيم Ka و Van في بروتياز العزلة المطفرة mg/ml 26.29 ، و mg 0.0021/min على التوالي. وسجلت أعلى فعالية تحلية البروتياز Rm4 و MW150 عند التراكيز %4% و 2% على التوالي للكازئين. كما قدرت قيم و اتجاه حليب الفرز معاد التكوين بناء على حساب نشاط تخثر الحليب، إذ بلغت 0.0034 0.152، و g/ml و Rm4 0.0030 على التوالي لبروتياز العزلة g/sec0.201، و g/ml. g/sec على التوالي لبروتياز العزلة MW150، وسجلت أعلى فعالية للتخثر البروتياز العزلتين Rm4 و MW150 عند تركيز 10%، و 15% على التوالي للحليب الفرز. وقد بلغت قيم V و اتجاه الحليب كامل الدسم معاد التكوين 00080 و sec 0.001 على التوالي البروتياز العزلة Rm4، بينما بلغت 0.2070 و 0.04800 g على التوالي البروتياز العزلة MW150 وسجلت أعلى فعالية للتخثر البروتياز العزلتين Rm4 و MW150 عند التراكيز 4% و 3.36% على التوالي للحليب كامل الدسم. استخدم بروتياز العزلة Rm4 المنقى لصناعة الجبن الأبيض وفقاً للطريقة التقليدية، بعد تحديد النسبة المثلى لإضافة الأنزيم إلى الحليب، التي بلغت 6000. وقد أظهر الجبن المنتج باستخدام المخثر الفطري تقارباً كبيراً مع الجبن المنتج باستخدام المنفحة التجارية، من حيث المردود الناتج، والخواص الحسية. الكلمات المفتاحية: أجبان، بروتياز الفين تنقية، حركية، طرائق حيوية، فعالية Rhizomucor michel ،أنزيمية