دراسة التعبير عن الجين (LACK) 36 في سلالة من الليشمانيا الجلدية ( الليشمانيا المدارية وإنتاج البروتين المؤشب LACK

Abstract

الملخص بعد داء الليشمانية الجلدي أحد الأمراض التي تسببها طفيليات أوالي تنتمي إلى جنس الليشمانيا والذي يهدد ملايين البشر حول العالم لا يتوفر علاج فعال تجاه الليشمالية الجلدية حتى الآن مما يجعل تطوير لقاح ناجع وفعال تجاهها حاجة ملحة ويعتقد بأن الجزيئات المناسبة والمرشحة لأن تكون لقاحات ناجحة تجاه الليشمانية يجب أن تكون معروضة على سطح الطفيلي في الطور داخلي السوط Amastigote وهو الطور المعدي للثدييات بعد المستضد P36/LACK ذو الوزن الجزيئي 36 كيلو دالتون مرشحاً قوياً لاستخدامه في تشخيص الإصابة بداء الليشمانية الجلدي وحتى استخدامه كلقاح وذلك بسبب موقعه على سطح الطفيلي بشكليه داخلي السوط وخارجي السوط Promastigote وقدرته على استثارة استجابة مناعية بذكرة جداً تجاه الخمج بطفيلي الليشمانيا اهتمت العديد من الأبحاث بدراسة التعبير عن المورثة P36/LACK لدى طفيلي الليشمانيا خلال أطوار مختلفة من دورة حياة الطفيلي إلا أن القليل منها ركز على دراسة هذا المستضد لدى الليشمانيا المدارية tropica ... اهتمت دراستنا بتنسيل وسلسلة المورثة P36/LACK المرمزة لهذا المستضد، ودراسة التعبير عن هذه المورثة في طفيلي الليشمانيا المدارية ومن ثم نقل المورثة إلى حامل تعبير مورثي وإنتاج البروتين بشكل مؤشب recombinant protein واستخلاصه و تنقيته بداية، لمط عدد من العزلات أو السلالات المحلية من طفيلي الليشمانيا جزيئياً بالاعتماد على التفاعل السلسلي للبوليميراز PCR ومن ثم تم عزل DNA الجينومي وتضخيم المورثة LACK/36 وإدخالها ضمن حامل من أجل سلسلتها وتحديد التتالي التكليوتيدي لها. بعد ذلك تم دراسة التعبير عن هذه المورثة على مستوى mRNA عن طريق تقانة RT-PCR، وذلك في كل من طوري النمو والاستتباب للشكل خارجي السوط بالإضافة للشكل داخلي السوط وتبين من خلال التنميط الجزيئي أن العزلات المحلية تعود للنوع tropica . تم تحديد التالي النكلوتيدي للمورثة وكان هناك تشابه كبير عند مقارنة هذا التثالي مع أنواع أخرى من الليشمانيا. كما أوضحت دراستنا أن المورثة P36/LACK تعبر عن نفسها في كلا الطورين خارجي وداخلي السوط طور من خلال هذا العمل نظام تعبير خاص لإنتاج البروتين بشكل مؤسب وذلك عن طريق نقل المورثة إلى حامل تعبير مورثي pRSET. إذ كان التركيب الجديد الناتج - PRSET) LACK/36 قادراً على التعبير عن البروتين P36/LACK في سيتوبلاسما بكتيريا الاشريكية القولونية E.coli ومن ثم تم تنقية البروتين المؤشب الناتج باستخدام تقانة الكروماتوغرافيا التالفية، والتأكد من تقاوته بالرحلان البروتيني SDS-PAGE بعد تلوين الهلامة باستخدام أزرق الكومازي. وللتأكد من هوية البروتين الناتج قمنا بإجراء اختبار التبصيم موجهة anti-6×His tag antibody باستخدام أضداد نوعية immunoblotting المناعي ضد ذيل عديد الهستدين المدمج بالبروتين المؤشب وأخيراً، اختبرت قدرة مجموعة من أمصال المرضى على التعرف على البروتين P36/LACK النقي بهدف استعماله في التشخيص المصلي للمرض ومن ثم اختباره كلقاح ضد الداء الجلدي المستوطن في سوريا.