إنتاج البروتياز الفطري بالطرائق الحيوية واستخدامه في صناعة الأجبان

Abstract

جمعت 45 عينة من التربة المحلية، حُصل منها على ست عزلات فطرية شُخصت ضمن النوع Rhizomucor miehei (Cooney et Emerson) Schipper. انتُخبت العزلة الأكفأ في إنتاج البروتياز ورُمزت بـ Rm4. حُددت الظروف المثلى لإنتاج البروتياز من العزلة Rm4 باستخدام منهجية الاستجابة السطحية بعد الغربلة الأولية لمكونات وسط التخمير. وقد تمثلت الظروف المثلى للإنتاج بالتخمير بالحالة السائلة في اختيار الجلوكوز والكازين كمصدرين للكربون والنيتروجين بالتراكيز 39.09g/L و10.24g/L على التوالي، وضبط الـ pH الابتدائي عند 5.99، والتحضين عند درجة حرارة 40.9°C، لمدة 89.94 ساعة. كما تمثلت الظروف المثلى للإنتاج بالتخمير بالحالة الصلبة في اختيار نخالة القمح كركازة بمحتوى رطوبي 80% ومُدعمة بالكازين بنسبة 1.33%، وضبط الـ pH الابتدائي عند 6.31، والتحضين عند درجة حرارة 41.1°C، لمدة 81.21 ساعة. وقد بلغت قيم نشاط التخثر النّوعي، ونسبة نشاط التخثّر/ النشاط الحال للبروتين للمستخلص الأنزيمي المنتج بالتخمير السائل تحت الظروف المثلى 303.87SU/mg و314.30 على التوالي، بينما بلغت في المستخلص الأنزيمي المنتج بالتخمير الصلب 441.90SU/mg و388.66 على التوالي. أُجري التطفر لتحسين إنتاج البروتياز بالمعاملة بإيثيل سلفونات الميثان، والأشعة فوق البنفسجية، والأمواج الميكروية وفق جرعات مختلفة. وقد أظهرت الطفرة المحدثة بالتعريض للأمواج الميكروية (2450MHz) لمدة 150sec تفوقها على باقي الطفرات الناتجة وفق جميع المؤشرات، إذ أظهر البروتياز المنتج تحسناً بمقدار 3.68، 1.98، 2.18 ضعفاً في كل من نشاط تخثّر الحليب الكلي، ونشاط التخثّر النوعي، ونسبة نشاط التخثّر/ النشاط الحال للبروتين، على التوالي بالمقارنة مع أنزيم العزلة الأصل. كما أظهرت هذه الطفرة ثباتاً في قدرتها على إنتاج البروتياز لمدة 8 أجيال، وقد رُمزت بـ MW150. أُجريت التنقية الجزئية لبروتياز العزلتين الأصل والمطوّرة بدءاً من الترسيب بسلفات الأمونيوم، ثم باستخدام عمود الترشيح الهلامي Sephadex G-100. وقد أدت خطوات التنقية إلى ارتفاع الفعالية النوعية لأنزيم العزلة Rm4 بمقدار 8.5 أضعاف، وبمردود 4.9%. كما ازدادت الفعالية النوعية لأنزيم العزلة MW150 بمقدار 5.19 أضعاف، وبمردود 4.01%. وباستخدام تقنية الرحلان الكهربائي (SDS-PAGE) قُدّر الوزن الجزيئي للبروتياز المنقى المنتج من كل من العزلتين Rm4 وMW150 بحوالي 39.77kDa و40.62kDa، على التوالي. تقارنت الخواص الحركية لكل من الأنزيم الطبيعي والمطوّر المنقيين، إذ تحقق أقصى نشاط لتخثّر الحليب عند درجة حرارة 57.5°C، وpH 5، وتركيز 9g/L من كلوريد الكالسيوم. كما تحققت أعلى قيم للنشاط الحال للبروتين عند درجة حرارة 57.5°C، وpH 4. وكانت الأنزيمات مستقرّة في المجال الحراري 40-50°C لمدة 48hrs، كما استقرت نسبياً عند الدرجات 60°C و70°C لمدة 105min و10min على التوالي، وثُبّطت عند التعرض للدرجتين السابقتين لفترات أطول. وكان الأنزيم مستقراً اتجاه التغيّر في قيم الـ pH ضمن المجال 3-7pH. وتمثّل أثر كلوريد الصوديوم في تحفيز نشاط تخثّر الحليب وتثبيط النشاط الحال للبروتين. وبلغت قيمة ثابت ميكاليس Km والسرعة القصوى Vmax لبروتياز العزلة Rm4 اتجاه الكازئين 19.46mg/mL و0.0026mg/min على التوالي بناءً على حساب النشاط التحلّلي، كما بلغت قيم Km وVmax في بروتياز العزلة المطوّرة 26.29mg/mL و0.0021mg/min على التوالي. وسُجّلت أعلى فعالية تحلّلية لبروتياز Rm4 وMW150 عند التراكيز 4% و2% على التوالي للكازئين. كما قُدّرت قيم Km وVmax اتجاه حليب الفرز مُعاد التكوين بناءً على حساب نشاط تخثّر الحليب، إذ بلغت 0.201g/mL و0.0030g/sec على التوالي لبروتياز العزلة Rm4، و0.152g/mL و0.0034g/sec على التوالي لبروتياز العزلة MW150، وسُجّلت أعلى فعالية لتخثّر لبروتياز العزلتين Rm4 وMW150 عند تركيز 10% و15% على التوالي للحليب الفرز. وقد بلغت قيم Vmax وKm اتجاه الحليب كامل الدسم مُعاد التكوين 0.080g/mL و0.001g/sec على التوالي لبروتياز العزلة Rm4، بينما بلغت 0.207g/mL و0.048g/sec على التوالي لبروتياز العزلة MW150. وسُجّلت أعلى فعالية للتخثّر لبروتياز العزلتين Rm4 وMW150 عند التركيز 4% و3.36% على التوالي للحليب كامل الدسم. استُخدم بروتياز العزلة Rm4 المنقى لصناعة الجبن الأبيض وفقاً للطريقة التقليدية، بعد تحديد النسبة المثلى لإضافة الأنزيم إلى الحليب، التي بلغت 6000SU/mL. وقد أظهر الجبن المنتج باستخدام المخثر الفطري تقارباً كبيراً مع الجبن المنتج باستخدام المنفحة التجارية، من حيث المردود الناتج، والخواص الحسية. الكلمات المفتاحية: أجبان، بروتياز، تطوير، تنقية، حركيّة، طرائق حيوية، فعالية أنزيمية، Rhizomucor miehei