دراسة الإنتاج الحيوي والدراسة الحركية لإنزيم ẞ- Galactosidase المعزول من سلالات بكتريا محلية

Abstract

الملخص

تم في هذه الدراسة إنتاج إنزيم Bgalactosidase من بكتيريا معزولة من حليب بعض أنواع الحيوانات (أبقار، أغنام، ماعز، ومن ترب قرب معامل الألبان من عدة محافظات سورية (حمص طرطوس، حماه). انتخبت وشخصت العزلة الأكثر كفاءة في إنتاج الإنزيم، فكانت من النوع subtilis .. تمت أمثلة ظروف الإنتاج باستخدام الركيزة الصناعية NPG، فكانت درجة الحرارة، و الـ pH، ومدة التحضين المثالية هي 35 م 7.5 ، 60 ساعة على الترتيب. كما درس تأثير بعض المعادن في نشاط الإنزيم، حيث أدت إضافة الأيونات Mn و Mg البيئة إنتاج الإنزيم إلى زيادة ملحوظة في فعالية الإنزيم، بينما لم تحقق إضافة المعادن 13 Fe Zn Cu تأثيراً إيجابياً في نشاط galactosidase- بل أدت إلى خفض فعالية الإنزيم. نقي الإنزيم galactosidase- من البكتيريا المدروسة باستخدام عمود تنقية الترشيح الهلامي 75-Sephadex G بعد الترسيب بالأسيتون، فكانت الفعالية النوعية لناتج التنقية 39.95 U/mg بغلة 7.044% عند دراسة العوامل الحركية للإنزيم النقي تبين أن درجة الحرارة المثلى الفعالية ولثباتية الإنزيم هي 55 و 65 على التوالي، وقيمة الـ pH المثلى التي حقق عندها الإنزيم أعلى فعالية وثباتية عند التحضين لمدة 15 دقيقة هي 7، وكان B-galactosidase 65.74 عين الوزن الجزيئي )U/ml) Vmax 11.11 وm - Km باستخدام SDS-PAGE فكان حوالي 79 كيلو دالتون كما غزل في هذه الدراسة الدنا الجينومي للبكتيريا B. subtilis. المنتجة للإنزيم B-galactosidase، وضخمت المورثة lacA المرمزة لهذا الإنزيم باستخدام مرئسات نوعية صممت لهذا البحث، ونقيت المورثة ناتج التضخيم من الهلامة، وربطت بالبلاسميد 156-pET للحصول على البلاسميد المؤشب pET-LacA الذي نسل إلى البكتيريا 2566 E.coli ER بطريقة النفاذ الكهربائي، كان الوزن الجزيئي للإنزيم المؤشب الناتج عن عملية التعبير البروتيني حوالي 80 ك. د. بلغت درجة الحرارة المثلى الفعالية الإنزيم galactosidase- المؤشب 555م، واحتفظ الإنزيم بأكثر من 95% من فعاليته ضمن المجال الحراري 35-45 م. كانت درجة الحموضة المثالية لفعالية الإنزيم المؤشب 7 ، وكان الإنزيم أكثر ثباتا عند pH بين 6-7